Введение

Регуляция процесса клеточной гибели является одной из центральных проблем биологии клетки, и интенсивно изучается сейчас во всем мире. Интенсивность исследований в этой области не ослабевают, поскольку решение проблемы детерминированности срока жизни клетки имеет прямое отношение к поддержанию гомеостаза многоклеточного организма и, следовательно, к биомедицинским задачам коррекции этого процесса в случае различных заболеваний. Известно, что запуск программы, ведущей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей. При действии подобных факторов на клетку, в ней запускается множество сигнальных путей, ведущих к нейтрализации последствий их отрицательного воздействия или, в случае непоправимого ущерба, к элиминации клетки. Такая элиминация поврежденных клеток происходит по пути апоптоза или программированной клеточной гибели. В развитии апоптотического процесса участвует множество сигнальных молекул, многие из которых регулируют и другие важные функции организма.

К физиологическим факторам, способным запускать в клетках апоптотическую программу, относится оксид азота (NO) - одна из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сердечно--сосудистой, нервной и иммунных систем организма. Уникальная химическая природа и большое число внутриклеточных мишеней для NO и его физиологически активных окислительно-восстановительных форм, оставляют открытым вопрос, каким образом и сколь специфично опосредуется повреждающее действие оксида азота на клетки. Использование фармакологических препаратов - источников (доноров) экзогенного оксида азота, является подходом для изучения запуска и реализации апоптотической программы в чувствительных клетках- мишенях, а также является перспективным направлением поиска новых селективных лекарственных средств.

Одним из подходов в изучении механизмов цитотоксической активности NO является использование экспериментальных моделей, в которых известны действующие молекулярные компоненты, определяющие гибель и регулирующие устойчивость клеток. К настоящему времени достигнут существенный прогресс в изучении, как механизмов программированной клеточной гибели (апоптоза), так и механизмов цитопротекции в условиях стресса. Широкое распространение в этих исследованиях получили модели культивируемых in vitro клеточных линий.

Целью данной работы было изучение in vitro цитотоксического действия нового биологически активного соединения - донора экзогенного NO 3-нитро-4-фенилфуроксана и факторов, влияющих на устойчивость к нему. В работе использовалась экспериментальная модель индукции апоптоза в клетках культивируемой опухолевой линии HeLa. В число задач работы входило выявление влияния экспрессии гена bcl-2 на индукцию клеточной гибели оксидом азота и доказательство апоптотического характера гибели клетки.

Обзор литературы

В последние годы на передовых рубежах биологии происходит смещение приоритетов от изучения генетических основ жизни к расшифровке механизмов реализации генетической информации, имеющейся, например, в зиготе, во все многообразие клеток, представленных во взрослом многоклеточном организме. В результате на первый план выходят исследования, касающиеся передачи сигналов между клетками и внутри каждой клетки. Одним из результатов таких сигналов может быть развитие программы клеточной гибели.

Программируемая клеточная гибель или апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточной популяции в многоклеточном организме. Основной его функцией является уравновешивание эффекта пролиферации клеток, элиминация поврежденных, например, радиацией, пораженных вирусом и неопластических клеток и селекция лимфоцитов, при которой удаляются аутоиммунные клоны. Апоптоз служит молекулярным механизмом, обеспечивающим старение и смертность живого организма, что, возможно, не очень полезно для индивида, но чрезвычайно важно для стабильности популяции (Скулачев В.П., 1997, Skulachev V.P., 2000b). Детерминированность срока жизни клетки и гибель ее после определенного числа делений (для большинства нормальных соматических клеток) также определяется включением механизмов апоптоза (Скулачев В.П., 1997; Хейфлик Л., 1997).

С другой стороны, чрезмерный апоптоз является ключевым событием во множестве заболеваний человека, таких как нейродегенеративные болезни, инфаркт миокарда, атеросклероз, СПИД, атрофия органов и другие патологии (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998; Haunstetter A. and Izumo S., 1998). Таким образом, интерес к апоптозу обусловлен не только с теоретической точки зрения как к базовому процессу в жизни клетки и организма, но и практическими нуждами, поскольку лечение многих патологий напрямую зависит от возможности регуляции клеточной гибели.

С точки зрения прикладных исследований можно условно выделить два направления в изучении апоптоза. С одной стороны, исследуются существующие сигнальные и рецепторные пути, регулирующие апоптоз в организме. Эти данные можно использовать с точки зрения коррекции апоптотических механизмов при патологиях, применяя эндогенные медиаторы. С другой стороны, ведется интенсивный поиск веществ искусственного происхождения, способных направленно воздействовать на процессы апоптоза, подавляя или активируя его. Эти вещества могут послужить прототипами новых фармакологических препаратов. С этой точки зрения интереснейшим объектом является монооксид азота, который служит эндогенным медиатором множества физиологических процессов, в том числе апоптоза, и в то же время может быть получен из большого числа химических соединений. Ниже будут описаны основные механизмы реализации апоптоза и участие в этих процессах оксида азота

КРИТЕРИИ АПОПТОЗА

Большинство исследователей выделяют сейчас две основные формы клеточной смерти: апоптоз и некроз. Список отличительных черт апоптоза постоянно растет и изменяется, однако есть несколько критериев, которые считаются характерными именно для апоптоза и наиболее часто применяются для его распознавания в ткани или клеточной культуре. Следует, однако, учитывать относительность и неоднозначность этих признаков, что делает необходимым сочетание нескольких методов для однозначной детекции апоптоза.

Морфологические критерии

Целостность плазматической мембраны при апоптозе не нарушается, хотя происходит ее выпячивание и "пузырение" за счет изменений цитоскелета. В ядре происходит конденсация хроматина и вытеснение его на периферию, само ядро также конденсируется, и в дальнейшем распадается на отдельные везикулы (Haunstetter A. and Izumo S., 1998; Kroemer G. et al., 1998; Новожилова А.П. и др., 1996). Морфологических изменений в митохондриях не заметно, хотя их функционирование серьезно нарушается. Ранее считалось, что увеличение объема этих органелл является более характерным для некроза (Kroemer G. et al., 1998), однако сейчас появляются данные, что и при апоптозе происходит существенное набухание митохондрий, вплоть до разрыва внешней митохондриальной мембраны (Tsujimoto Y. and Shimizu S., 2000, Gottlieb R.A., 2000, Kowaltowski A.J. et al., 2001). На заключительных стадиях апоптоза происходит конденсация цитоплазмы и формирование апоптозных телец. Остатки клетки фагоцитируются макрофагами или соседними клетками, поэтому клеточное содержимое не попадает в межклеточное пространство и не вызывает никакой воспалительной реакции.

Молекулярно-биохимические критерии

Апоптоз является активной формой клеточной гибели, поэтому он, в отличие от некроза, энергозависим и требует обязательного наличия АТФ: изменение его уровня может определять направление гибели клетки по апоптотическому или некротическому пути (Kroemer G. et al., 1998, Bal-Price A.and Brown G.C., 2000, Beltran B. et al., 2000), причем решающим может являться даже не абсолютное количество АТФ, а отношение АТФ/АДФ в клетке. Характерным признаком апоптоза служит межнуклеосомальное расщепление ядерной ДНК и формирование фрагментов кратных 200 п. н., что приводит к появлению характерных "лестниц" ДНК на электрофореграмме; при развитии другого пути апоптоза ДНК может расщепляться на более крупные фрагменты (Susin S.A. et al., 1999). Программированная клеточная гибель включает в себя активацию специфических цистеиновых протеаз (каспаз) и обусловленную ими деградацию белка в клетке (Haunstetter A. and Izumo S., 1998; Kidd V.J., 1998). Каспазы относятся к семейству, так называемых ICE-подобных аспартат-специфичных протеаз, существующих в клетке в виде неактивных проформ. При активации прокаспаза расщепляется на большую и малую субъединицы, которые в конечном счете объединяются с образованием тетрамера из двух малых и двух больших субъединиц (Li J. et al, 1999). Каспазы разрезают белок специфично за остатком Asp (этот сайт расщепления уникален для каспаз и протеазы гранзим В), причем при активации прокаспазы расщепление происходит тоже по этому остатку. Таким образом, активация каспаз может происходить либо автокатализом, либо расщеплением другой каспазой или гранзимом В, эта особенность обуславливает существование каскадного механизма активации каспаз.

В цитоплазматической мембране при апоптозе, несмотря на ее морфологическую целостность, наблюдается исчезновение асимметрии слоев, характерной для интактных клеток, и экспозиция фосфатидилсерина на наружном слое мембраны. Имеются данные (Kagan V.E. et al, 2000), что медиатором этого процесс является окислительный стресс, и что в нем кроме ферментов цитоплазматической мембраны участвует и цитохром С. Именно появление фосфатидилсерина на поверхности клетки (и апоптотических телец, образующихся из нее) способствует их узнаванию макрофагами и фагоцитозу (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998).

УЧАСТИЕ МИТОХОНДРИЙ В РАЗВИТИИ АПОПТОЗА

Митохондрия как регулятор клеточной гибели

Сейчас считается общепризнанным, что митохондрия играет одну из ключевых ролей в развитии и регуляции апоптотической программы в клетке. На этой органелле сосредоточено множество сигнальных путей, и они образуют столь сложную систему взаимовлияний, что во многих случаях механизмы действия того или иного сигнала не выяснены, а данные от разных исследователей абсолютно противоположны.

Первоначально считалось, что митохондрии не участвуют в апоптозе, так как их морфология часто остается неизменной, однако теперь доказана их первостепенная роль для многих, если не всех видов ПКГ. В первую очередь изменение функционирования митохондрий при апоптозе выражается в падении трансмембранного потенциала Dy на внутренней мембране митохондрий (Kroemer G. et al., 1998, Tsujimoto Y. and Shimizu S., 2000). Сейчас, однако, появляются свидетельства и противоположной роли рассеивания Dy в развитии апоптоза (Salvioli S. et al, 2000), так как в некоторых клеточных системах деполяризация митохондриальной мембраны отменяет развитие апоптоза. Тем не менее, рассеивание Dy является общей чертой апоптоза для большинства типов клеток (нейроны, фибробласты, моноциты, лимфоциты, гепатоциты, различные опухолевые клетки и др.) и не зависит от индуктора апоптоза (токсины, неоптимальные условия культивирования, специфическое связывание с рецепторами (Fas, TNFR, рецепторы глюкокортикоидов) или удаление облигатных факторов роста, например, сыворотки). Это достаточно раннее событие в развитии апоптоза, за которым следуют характерные апоптотические изменения (конденсация хроматина, расщепление PARP и т.д). Однако, среди исследователей нет на сегодняшний день единого мнения, является ли коллапс Dy причиной или следствием изменений, происходящих в клетке при ПКГ.

Вместе с падением Dy в митохондриях происходят более глубокие изменения, связанные с сильным изменением проницаемости мембран и выходом из межмембранного пространства различных, в том числе апоптогенных, факторов. Именно нарушение барьерной функции митохондриальных мембран является ключевым процессом в развитии многих типов апоптоза. Этот процесс связан с образованием в митохондриальных мембранах мегаканалов, так называемых гигантских пор (в англоязычной литературе permeability transition pore (PTP)), открытие которых приводит к драматическим последствиям для митохондрии и всей клетки. Комплекс поры имеет весьма сложное строение и систему регуляции, это обусловлено тем, что изменение проницаемости митохондриальных мембран представляет одно из центральных координационных явлений апоптоза.

Точный состав порового комплекса, не смотря на длительное изучение, не известен. По косвенным данным считается, что он может включать в себя цитозольные белки (гексокиназа); белки наружной мембраны (зависимый от напряжения анионный канал (VDAC), периферический бензодиазепиновый рецептор PBR, порины); внутримембранные белки (креатин киназа); по меньшей мере, один белок внутренней мембраны (аденин-нуклеотидный транслокатор) и, по меньшей мере, один белок матрикса (циклофилин Д). Вероятнее всего пора как таковая образуется во внутренней мембране митохондрии (Kowaltowski A.J. et al. 2001, Gottlieb R.A. 2000), но при этом может также взаимодействовать с белками других мультипротеиновых комплексов, такими как Tim (транспортер внутренней мембраны), Tom (транспортер наружной мембраны) и Bcl-2 комплекс (Kroemer G. et al., 1998). Имеются данные, что минимальный комплекс гигантской поры можно воссоздать, используя VDAC, ANT и циклофилин D (Crompton M., 1999).

Каким бы ни был его точный состав, комплекс гигантской поры содержит множество мишеней для внешнего воздействия и регулируется множеством эндогенных физиологических эффекторов. Вот далеко не полный список этих эффекторов: оксид азота (рассмотрение его эффектов является центральным в этой работе), активные формы кислорода; концентрация ионов (главным образом Ca2+ и Mg2+); изменения Dy; концентрация адениновых нуклеотидов (АДФ, АТФ); пиримидиновый редокс-статус (NAD(P)+ против NAD(P)Н2), тиоловый редокс-статус (контролируется глутатионом); концентрации липидов; определенные пептиды; изменения в составе Bcl-2 комплекса. Судя по всему, гигантская пора интегрирует различные ответные реакции клетки на стресс, и почти все процессы клеточной гибели вызывают изменение митохондриальной проницаемости.

При нормальных обстоятельствах внутренняя мембрана митохондрии является почти непроницаемой, тогда как во внешней имеются каналы (в основном это VDAC), способные пропускать молекулы до 1000 Да. Открывание гигантской поры делает митохондриальные мембраны проницаемыми для растворенных веществ с молекулярной массой 1500 Да и более. Такое изменение проницаемости приводит к немедленной диссипации Dy. Затем нарушается метаболизм митохондрий, прекращается синтез митохондриальных белков и импорт белков, синтезированных в цитозоле. Идет разобщение окислительного фосфорилирования и прекращение синтеза АТФ, начинается гиперпродукция О2- и исчерпание восстановительных эквивалентов. Всех этих изменений достаточно, чтобы вызвать некроз, но как изменение проницаемости включает апоптоз?

Существует несколько теорий участия гигантской поры в апоптотических сигнальных путях. Итог открытия поры - это всегда выход из митохондрии различных апоптогенных факторов, но предлагаемые механизмы этого процесса различны. Kroemer G. и др. считают, что сама пора, проходя через обе митохондриальные мембраны в месте их сближения, образует канал, позволяющий выходить из межмембранного пространства в цитоплазму белкам, находящимся в митохондрии в обычных условиях. Другие исследователи (Gottlieb R.A., 2000, Kowaltowski A.J. et al., 2001, Skulachev V.P., 2000a) предлагают механизм, при котором пора открывается только во внутренней мембране, это вызывает нарушение распределения ионов между матриксом и цитоплазмой, происходит набухание митохондрии, приводящее к разрыву внешней мембраны и высвобождению апоптогенных факторов.

Основными факторами, выбрасываемыми митохондрией в цитоплазму являются цитохром С и апоптоз-индуцирующий фактор (AIF), а также прокаспазы 2, 3 и 9 (Gottlieb R.A., 2000). Недавно показано, что белки DAP3 и PDCD9, входящие в состав митохондриальных рибосом, являются апоптогенными и участвуют во многих сигнальных путях, обеспечивающих клеточную смерть (Koc E.C. et al., 2001).

Цитохром С, выйдя в цитоплазму, связывается с белком араf-1, прокаспазой-9 и АТР и инициирует каскад протеолитических ферментов семейства каспаз (Kroemer G. et al., 1998; Haunstetter A. and Izumo S., 1998; Kidd V.J., 1998). Араf-1 считается каркасным белком, основная функция которого состоит в сближении остальных компонентов и формировании инициирующего комплекса. Инициация каскада происходит за счет того, что специальный домен араf-1 связывает две молекулы прокаспазы-9, их активные центры сближаются и активируют друг друга. Каспазы, активируя друг друга в каскаде, накапливаются в клетке и поражают свои многочисленные мишени, среди которых ламин ядра (Haunstetter A. and Izumo S., 1998; Андреева Л.И. и др., 1996), регуляторные белки ядра, поли(АДФ-рибозо)полимераза (PARP), некоторые киназы, актин, белки цитоскелета, фактор фрагментации ДНК (DFF). В результате расщепления DFF происходит конденсация хроматина и расщепление ДНК (Earnshaw W.C., 1999; Susin S.A. et al., 1999).

Другой митохондриальный апоптогенный белок, выходящий в цитоплазму назван AIF. Он обеспечивает другой путь апоптоза и, как показано, может сам по себе вызывать конденсацию хроматина, фрагментацию ДНК и падение Dy в митохондриях (Susin S.A. et al., 1999). AIF является флавопротеином (57кД) и имеет гомологию с некоторыми бактериальными оксидоредуктазами. Впрочем, показано, что предполагаемая оксидоредуктазная активность AIF не является необходимой для его апоптогенных функций. Сейчас выявлена локализация гена AIF, проведено клонирование и произведен подробный функциональный анализ этого белка (Susin S.A. et al., 1999). Известно, что при добавлении AIF к изолированным ядрам, он вызывает быструю (в течение 1 мин.) конденсацию хроматина и крупнокусковую фрагментацию ДНК (фрагменты около 50 тыс. п. н.), но не вызывает олигонуклеосомальную фрагментацию ДНК. При действии на изолированные митохондрии AIF заставляет их высвобождать в раствор цитохром С и каспазу-9. Эти свойства AIF позволяют предположить наличие в живой клетке in vivo петли положительной обратной связи, в результате которой происходит амплификация сигнала и очень быстрое его распространение. Показано, что выход цитохрома С и AIF из одной митохондрии происходит за 1 минуту, а из всех митохондрий клетки за 5 минут, причем изменение проницаемости митохондрий после подачи апоптотического сигнала носит взрывной характер. После выхода AIF в цитоплазму он начинает активно транспортироваться в ядро, для чего в его аминокислотной последовательности существуют специальные сигналы ядерной локализации (NLS).

Таким образом, можно сделать вывод о существовании двух независимых путей, связывающих митохондрию с ядерным апоптозом: AIF, действующий на ядро самостоятельно, и цитохром С, действующий через каспазный каскад.

Регуляция митохондриальной поры комплексом Bcl-2

Как было сказано выше, комплекс белков семейства Bcl-2 взаимодействует с гигантской порой. Это взаимодействие является важнейшим звеном регуляции проницаемости митохондрии. Все суперсемейство относящихся к Bcl-2 белков рассматривается, как один из наиболее значимых классов апоптоз-регулирующих генных продуктов. В их постоянно расширяющийся список входят как белки, являющиеся антагонистами клеточной смерти, так и белки, вызывающие апоптоз. Ввиду большого числа описанных на сегодняшний день представителей этого семейства их принято делить на три группы (Tsujimoto Y. and Shimizu S., 2000):

1. Антиапоптотические белки Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-1 и Boo с гомологией в областях ВН1, 2, 3 и 4.

2. Проапоптотические белки Bax, Bak, Bad, Bok и Diva с гомологией в областях ВН1, 2 и 3, но не ВН4.

3. "ВН3-белки", проапоптотические белки Bik, Bid, Bim, Hrk и Blk, имеющие гомологию только в ВН3 домене.

Первый член этого семейства белков, Bcl-2, был обнаружен в клетках В-клеточной лимфомы и охарактеризован как протоонкоген, обладающий ярко выраженным антиапоптотическим действием (Chao D.T. and Korsmeyer S.J., 1998). Затем он был найден и в других клетках, а его функциональная важность (как и других членов семейства) доказана в опытах по трансфекции или прицельному нокаутированию генов bcl-2 семейства (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998). Мыши, нокаутированные по Bcl-2, характеризуются массивным апоптозом лимфоцитов и некоторых других клеток. Трансфекционно вызванная сверхэкспрессия Bcl-2 ведет к защите клеток от большинства апоптоз-индуцирующих агентов. Прицельное разрушение bax-гена наоборот, приводит к гиперплазиям и новообразованиям.

Суммарное действие родственных агонистов и антагонистов клеточной смерти из семейства Bcl-2 представляет собой регуляторный переключатель, чьи функции определяются, по меньшей мере в части случаев, избирательным белок-белковым взаимодействием. Для этих белков характерна способность образовывать гетеродимеры, в которых партнеры подавляют друг друга.

Проапоптотические белки локализованы по большей части в цитозоли и транслоцируются к митохондриальной мембране в ответ на определенные стимулы. В некоторых работах утверждается, что Вах переходит из цитозоли к митохондрии, тогда как другие предполагают, что он претерпевает конформационные изменения, усиливаемые взаимодействием с Bid (см. обзор Gottlieb R.A., 2000). Про Bid известно, что он гидролизуется каспазой-8 и С-концевая его часть взаимодействует с митохондрией (Zhai D. et al., 2000). Предложено несколько моделей участия белков Bcl-2 семейства в регуляции перехода белков из митохондрии в цитозоль.

1. Поскольку Вах (как и другие белки Bcl-2 семейства) может формировать поры во внешней мембране митохондрии, то предполагали, что размер этих пор может быть достаточным для выхода цитохрома С. Однако, подтверждений этому пока не получено.

2. Другая модель (Tsujimoto Y. and Shimizu S., 2000) предполагает взаимодействие Bax и VDAC, в результате которого образуется еще больший канал, способный вместить цитохром С. Причем проводимость этого канала блокируется Bcl-xL.

3. Bcl-2 также может образовывать каналы во внешней мембране митохондрии, которые пропускают адениновые нуклеотиды. Поэтому существует модель (Vander Heiden M.G. et al., 1997), в которой Вах закрывает VDAC, нарушается обмен АТФ/АДФ между митохондрией и цитоплазмой, в результате чего происходит открывание РТР. Причем все эти явления предотвращаются Bcl-2.

4. Наконец, существует модель, где комплекс белков Bcl-2 семейства взаимодействует с комплексом гигантской поры во внутренней мембране митохондрии (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998; Chao D.T. and Korsmeyer S.J., 1998; Kroemer G. et al., 1998). Открывание этой поры приводит к деполяризации мембраны, набуханию митохондрии и выходу цитохрома С (Kowaltowski A.J. et al., 2001, Skulachev V.P., 2000a и b).

Белок Bcl-2 оказывает прямое ингибирующее действие на открывание пор, но он защищает не от всех индукторов изменения проницаемости. Поскольку пора регулируется комплексом, в который входят антагонисты Bcl-2 и Bax, то изменения в его стехиометрии (например, возрастание синтеза Bax или модификация Bcl-2) могут содействовать изменению проницаемости. Предложена модель (Брюне Б. и др., 1998), в которой соотношение между Bcl-2 и Bax и их фосфорилирование способствуют либо выживанию клетки (избыток Bcl-2 или Bcl-xL), либо ее гибели (избыток Bax, фосфорилирование Bcl-2). На уровне фосфорилирования обнаруживается связь изменения митохондриальной проницаемости с рецепторными сигнальными путями, поскольку фосфорилирование могут производить такие протеин киназы как JNK (активируется при действии различных стресс стимулов и через рецепторы TNFR и Fas, фосфорилирует Bcl-2) и PKB/Akt, которая передает сигналы факторов роста NGF, IGF-1, фосфорилирует Bad, предотвращая апоптоз (Новиков В.С. и др., 1996а; Андреева Л.И. и др., 1996; Haunstetter A. and Izumo S., 1998).

Важным замечанием к вышесказанному является то, что цитохром С диссоциирует от внутренней митохондриальной мембраны и прекращает участвовать в электронном транспорте еще до разрыва наружной мембраны. Показано, что диссоциацию цитохрома С вызывает расщепленный каспазой-8 Bid. В недавней работе (Zhai D. et al., 2000) также сообщалось, что tBid (расщепленный Bid) может сам вызывать выход цитохрома С причем даже в отсутствие каких-либо белков (в искусственных липосомах), возможно за счет взаимодействия с липидами.

Итак, предлагается несколько механизмов открывания гигантской поры и выхода цитохрома С. Еще больше существует путей регуляции этих событий и взаимодействий между их участниками. Несомненно, потребуется много исследований для составления четкой картины участия митохондрии в апоптозе и влияния на нее всевозможных сигнальных молекул. Вероятно, не последнее место среди таких мессенджеров будет занимать оксид азота, о котором пойдет речь ниже.

ОБРАЗОВАНИЕ ОКСИДА АЗОТА И АПОПТОТИЧЕСКАЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК

Поскольку апоптоз является очень сложно регулируемым процессом, то и количество сигнальных путей, эффекторных механизмов и мессенджеров, участвующих в этом явлении, поистине огромно. Одним из таких веществ является оксид азота, участие которого в программируемой клеточной смерти и будет рассмотрено ниже.

Химическая биология NO

Оксид азота (NO) является уникальной молекулой, обладающей, несмотря на крайнюю простоту строения, большим набором функций в организме, что послужило причиной его детального изучения в последнее десятилетие. NO функционирует как ключевой элемент в сердечно-сосудистой системе, обеспечивая расширение сосудов и регуляцию артериального давления, он участвует в передаче сигналов в центральной и периферической нервной системе. Большинство этих эффектов оксида азота связано с активацией растворимой гуанилатциклазы и образованием циклического GMP (Брюне Б. и др., 1998; Северина И.С., 1998). NO также чрезвычайно важен для системы неспецифического иммунитета. На мышиных макрофагах, а затем и на различных других макрофагах, было показано, что NO необходим для обеспечения их цитотоксического действия на опухолевые клетки и клетки, пораженные вирусом (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998). Механизм действия оксида азота в этом случае не связан с активацией гуанилатциклазы и обусловлен, в основном, эффектами самого NO. В этой связи следует указать на свободнорадикальную природу молекулы оксида азота (наличие неспаренного электрона у атома азота), что делает его весьма реакционно-способным соединением. Среднее время жизни NO in vivo составляет 5-30 секунд (Недоспасов А.А., 1998), он достаточно быстро взаимодействует со своими мишенями (в основном, тиолами и переходными металлами) или окисляется до неактивных нитрата и нитрита, например, цитохром С оксидазой (Torres J. et al., 2000), или образует так называемые активные формы азота. Таким образом, действие NO носит прямой или косвенный характер. Прямое действие обусловлено реакциями самого NO с мишенями, например, стимуляция гуанилатциклазы, образование нитрозильных комплексов с металлами (часто в результате этого ферменты, содержащие ионы этих металлов, инактивируются) и др. Непрямые эффекты NO определяются как химические реакции, опосредованные активными формами оксида азота, которые образуются при взаимодействии с супероксидом (О2-) или кислородом (О2). В результате действия активных форм NO развивается либо нитрозилирующий стресс (образование нитрозоаминов, S-нитрозотиолов, дезаминирование оснований ДНК), либо окислительный стресс (Винк Д.А. и др., 1998). Благодаря высокой липофильности NO столь эффективно проникает через мембраны, что способен распространяться от источника на расстояния, в несколько раз превышающие размеры клетки, и поражать там свои мишени (Недоспасов А.А., 1998).

Синтез NO в организме

Изучение вопроса происхождения эндогенного NO показало, что для его продукции активными макрофагами необходим L-аргинин. В дальнейшем было выяснено, что выработка обеспечивается семейством NO-синтаз (NOS), которые в процессе работы образуют из L-аргинин NO и L-цитруллин, одновременно окисляя NADPH и восстанавливая кислород до воды (Горрен А.К.Ф. и Майер Б., 1998). Оказалось, что NOS присутствуют в клетках практически всех типов тканей и по типу экспрессии их разделяют на конститутивно присутствующие в клетках cNOS и индуцибельные iNOS. Группа cNOS обычно делится на нейрональную ncNOS (NOS1) и эндотелиальную ecNOS (NOS3) по месту их основной локализации, хотя они находятся и в других клетках. iNOS ассоциирована в основном с макрофагами и участвует в работе иммунной системы (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998), накапливаясь в этих клетках после активации их цитокинами (IFN-g, IL-1b , TNF-a) и другими агентами (ЛПС). В печени при стимуляции также экспрессируется эта изоформа, что связано с барьерной функцией этого органа (Тейлор Б.С., 1998). Комплексное изучение NOS показало, что они являются одними из наиболее сложно устроенных и регулируемых ферментов, имеющих необычно высокое количество кофакторов (рис.1).

NO-синтазы существуют в клетке в виде димера и активны только в таком состоянии. В составе каждой субъединицы димера различают редуктазный, кальмодулинсвязывающий и оксигеназный домены. Редуктазный домен содержит флавины FAD и FMN: FAD является первичным акцептором электронов от NADPH, а FMN переносит электроны от FAD на гем оксигеназного домена. Оксигеназный домен содержит участки связывания гема, аргинина (L-Arg) и тетрагидробиоптерина (ВН4). Считается, что кальмодулин-Са2+ придает ферменту конформационное состояние, необходимое для внутреннего переноса электронов (Горрен А.К.Ф. и Майер Б., 1998). Именно различия в прочности связывания кальмодулина с димером NOS обуславливает каталитические различия изоформ: активность nNOS и eNOS сильно зависит от концентрации Са2+, в то время как с iNOS кальмодулин связан столь прочно, что она не нуждается в добавлении Са2+. Хотя удельные активности всех изоформ NOS одинаковы, при работе в организме оказывается, что сNOS синтезирует небольшие концентрации NO в течение короткого времени, а iNOS синтезирует значительно большие концентрации NO в течение длительных периодов (до нескольких дней). Таким образом, экспрессия и активность той или иной изоформы может обуславливать способность NO выступать в качестве физиологического регулятора или же токсического агента (Винк Д.А. и др., 1998).

Изучение NO-опосредованной цитотоксичности макрофагов, проводимое in vitro, отчетливо показало, что добавление в среду ингибиторов NOS, таких как аналог субстрата NG-монометил-L-аргинин (L-NMMA), подавляет цитотоксический эффект макрофагов на опухолевые клетки. Это свидетельствует в пользу доминирующей роли NO в опосредовании этого воздействия макрофагов на клетки-мишени, хотя следует помнить и об известном явлении дыхательной вспышки, играющей существенную роль в уничтожении патогенов фагоцитами. В частности появились данные, усложняющие схему макрофагальной цитотоксичности, обусловленной оксидом азота. Выяснено, что раневые макрофаги, способные к выработке NO, не являются цитотоксичными для NO-чувствительных клеток линии Р815. Таким образом, встает вопрос о необходимости и достаточности NO для проявления цитотоксичности макрофагов (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998).

Следует упомянуть также о том, что производство NO вызывает значительные отрицательные эффекты и в продуцирующих его макрофагах. Показано, что фагоцитоз и выработка активных форм кислорода сильно подавляется у крысиных или перитонеальных макрофагов, культивируемых в условиях, позволяющих производить NO. Макрофаги, экспрессирующие iNOS или обработанные оксидом азота, имеют конденсированное ядро и цитоплазму. Таким образом, выделение NO активированными макрофагами ведет к их функциональной супрессии, в конце концов, к апоптозу. Эти явления явно связаны с NO, поскольку предупреждаются добавлением ингибиторов NOS.

Механизмы цитотоксичности NO

Сейчас идет активное изучение мишеней оксида азота и выяснение вопроса, является ли NO per se достаточно цитотоксичным, или же более активны его производные. Известно, что NO в клетках-мишенях образует активные интермедиаты, такие как нитрозоний (NO+), нитроксил (NO-) и пероксинитрит (ONOO-). В этой связи некоторые исследователи (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998; Estevez A.G. et al., 1999; Маеда Х. и Акаике Т., 1998) считают, что большинство цитотоксических эффектов NO принадлежит на самом деле ONOO-, который образуется в реакции с супероксидом (O2-). Действительно, пероксинитрит значительно более активен, он интенсивно нитрозилирует белки и может являться источником очень токсичного гидроксил-радикала ·ОН в реакции

NO· + O2- а ONOO- + H+ а ONOOH а ONO· + · OH

ОН· вызывает перекисное окисление липидов и другие явления, входящие в понятие "окислительный стресс".

Другая проблема, возникающая при исследовании механизмов цитотоксичности азота, связана с используемыми для его генерации NO-донорами, описанными выше. Дело в том, что S-нитрозотиолы (в основном, GSNO и SNAP), используемые во многих исследованиях, способны участвовать в реакциях транснитрозилирования, то есть передавать NO+ группу тиолам (глутатиону и SH-группам белков) и таким образом нарушать их функционирование в клетке (Borutaite V. et al., 2000). При этом непонятно, относить ли такие реакции к эффектам собственно NO.

Ниже будут рассмотрены некоторые возможные механизмы цитотоксического действия оксида азота (на рис.2 представлена обобщенная схема цитотоксических эффектов NO), при этом некоторые реакции могут вызываться его производными.

Показано, что в первую очередь NO (макрофагальный или экзогенный) ингибирует окислительное фосфорилирование в митохондриях клеток-мишеней. Это происходит, так как NO обратимо связывается с цитохром оксидазой ЭТЦ митохондрии. С другой стороны, подавление электронного транспорта в митохондрии приводит к генерации супероксида, и образованию пероксинитрита. ОNOО-, который подавляет ферменты дыхательной цепи уже не обратимо, нитрозилируя их и отнимая железо (Moriya R. et al., 2000). Подавление митохондриального дыхания приводит к падению Dy, что может инициировать апоптотический процесс (Borutaite V. et al., 2000). С другой стороны известно, что при отсутствии глюкозы или блокировании гликолиза NO-индуцированное подавление дыхания приведет скорее к некрозу, чем к апоптозу (Bal-Price A. and Brown G.C., 2000)

Имеются данные и о прямой активации открытия гигантской поры оксидом азота (Hortelano S. et al., 1997, Balakirev M.Yu. et al., 1997), приводящей к выходу цитохрома С и запуску каспазного каскада. Это, однако, тоже спорный момент, так как другие исследователи (Brookes P.S. et al., 2000) показали, что низкие дозы NO (близкие к физиологическим) замедляют открытие гигантской поры и апоптоз, тогда как ONOO и нитрозотиолы способствуют им.

NO и его производные могут вызывать перекисное окисление фосфолипидов и окисление тиольных групп белков митохондриальной мембраны (Ushmorov A.. et al., 1999), что также приводит к высвобождению в цитозоль апоптогенных факторов.

Нитрозилирование белков по остаткам тирозина (Reiter C.D. et al., 2000), осуществляемое ONOO-, может иметь серьезные функциональные последствия, так как оно подавляет фосфорилирование Tyr, то есть нарушает некоторые пути передачи сигнала в клетке. Недавно сообщалось (Cassina A.M. et al., 2000), что пероксинитрит может нитрозилировать и цитохром С в митохондриях, что приводит к изменению его функций, в частности он становится неспособен поддерживать перенос электронов в дыхательной цепи и не восстанавливается аскорбатом. Поскольку одновременно происходит выход цитохрома С (в том числе и нитрованного) в цитоплазму, то можно предполагать участие такого нитрозилирования и в каких-то сигнальных процессах. В этом отношении сейчас появляются гипотезы о том, что селективное нитрозилирование некоторых белков может являться регуляторным процессом, в чем-то похожим на фосфорилирование (Nedospasov A. et al., 2000).

Спектр активности пероксинитрита включает также нитрозилирование гуанина и разрывы цепочек ДНК, что может приводить к мутациям или запуску процессов апоптоза (Маеда Х., Акаике Т., 1998; Estevez A.G. et al, 1999). В отношении повреждений генома известен еще один эффект NO: продукты его реакции с О2 ингибируют ферменты, ответственные за репарацию ДНК. В зависимости от источника (разные доноры NO) показано действие NO на алкилтрансферазу, формамидопиримидин-ДНК-гликозилазу и лигазу (Винк Д.А. и др., 1998). Известно также, что NO может активировать PARP и ADP-рибозилирование (Moriya R. et al., 2000, Bal-Price A. and Brown G.C., 2000), возможно вследствие разрывов ДНК, но это скорее приводит к некрозу из-за истощения пула NAD и ATP.

В связи с действием NO и его производных на ДНК интересны данные о его влиянии на экспрессию р53. Белок р53, подавляющий рост опухолей, поддерживает целостность генома и может вызывать остановку клеточного цикла или апоптоз. Известно, что р53 может индуцировать экспрессию Bax, Fas, p53AIP (apoptosis inducing protein) и других апоптогенных белков (Moll U.M. and Zaika A., 2001), а также сам перемещается в митохондрию при апоптозе, что может быть одной из причин выработки АФК и падения Dy (Moll U.M. and Zaika A., 2001). В норме концентрация р53 в клетке очень мала и он быстро деградирует. Повреждение ДНК ведет к накоплению р53. В экспериментах на макрофагах и клетках инсулиномы RINm5F выявлено накопление р53 при гибели клеток вызванной NO (Брюне Б. и др., 1998). Выяснилось, что L-NMMA (ингибитор NOS) подавляет накопление р53, вызванное действием цитокинов или LPS, что указывает на активную роль NO. По некоторым данным этот эффект NO связан с его способностью подавлять функционирование протеосомы (Glockzin S. et al., 1999). Однако, эксперименты выявили также функционирование р53-независимых путей при NO-индуцированном апоптозе. В других работах (Тейлор Б.С. и др., 1999) обнаружено существование в разнообразных клетках человека отрицательной обратной связи между соотношением NO и р53: повреждение ДНК, вызванное накоплением NO, активирует экспрессию р53, а он репрессирует ген iNOS человека. NO также подавляет экспрессию iNOS путем ослабления активности NFkB в гепатоцитах. Этими путями достигается жесткая регуляция синтеза NO, что предупреждает его повреждающее действие на ткань.

Взаимодействие NO с митохондрией

Поскольку участие митохондрии и оксида азота в апоптозе уже подробно рассматривалось в данной работе, то не лишним будет описать их совместное участие в его регуляции. В экспериментах по трансфекции макрофагов линии RAW264.7 человеческим Bcl-2 трансфецированные клетки были защищены от гибели, вызванной активацией iNOS (Брюне Б. и др., 1998). Сделано заключение, что Bcl-2 работает посредством снижения до нуля NO-индуцированного повышения экспрессии белка Bax. В других опытах клетки опухолевой линии Р815, трансфецированные Bcl-2, были устойчивы к действию NO-донора SNAP (S-нитрозо-N-ацетилпеницилл-амин) и к NO-ассоциированной цитотоксичности активированных мышиных макрофагов (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998). Клетки L929 были защищены сверхэкспрессией Bcl-2 от апоптоза, вызванного активацией iNOS. Множество других примеров взаимодействия NO с Bcl-2 приведено в обзоре Брюне (Брюне Б. и др., 1998).

Взаимодействие NO с членами суперсемейства Bcl-2 выражается также в том, что при действии оксида азота на клетку сильно понижается уровень внутриклеточного Bcl-2 белка (Tejedo J. et al., 1999), возможно, через каспаз-индуцированнлое расщепление или р53-зависимое подавление его экспрессии (Messmer U.K. and Brune B., 1996), хотя есть и противоположные свидетельства (Li J. et al., 1999, Rossig L. et al., 2000). Проапоптотический эффект оксида азота выражается также в индуцируемом им повышении экспрессии Вах (Albina J.E. and Reichner J.S., 1998, Messmer U.K. and Brune B., 1996).

В дополнение к описанным выше функциям митохондрий следует упомянуть последние исследования в этой области, показывающие, что митохондрия имеет отношение не только к восприятию апоптотического сигнала от NO, но и к производству самого NO. Действительно, в последних работах показано наличие конститутивной формы NOS в митохондриях (Ghafourifar P. et al., 1999; Giulivi C. et al., 1998; Tatoyan A. and Giulivi C., 1998). В первую очередь производство NO было обнаружено в митохондриях печени крыс. Были проведены работы по очистке митохондриальной NOS и изучению ее ферментативных характеристик (Tatoyan A. and Giulivi C., 1998). Было показано, что эта изоформа NOS локализована в митохондриальной мембране, судя по всему во внутренней. Оказалось, что mtNOS очень схожа с макрофагальной iNOS, но экспрессируется конститутивно. Пока не ясно, считать ли mtNOS отдельной изоформой, или это iNOS, содержащая пост-трансляционные модификации, которые ведут к иной субклеточной локализации. Показана независимость этой NO-синтазы от добавления кальмодулина и кальция, что говорит о ее прочной связи кальмодулином.

Очищенная mtNOS при субоптимальных концентрациях L-Arg способна продуцировать О2-, однако с не слишком значительной скоростью. Это коррелирует с наблюдаемой гомологией С-концевого домена NOS к NADPH : цитохром Р450-оксидоредуктазе, которая тоже обладает NADPH-оксидазной активностью и вырабатывает О2-, но в 10 раз быстрее, чем mtNOS (Tatoyan A. and Giulivi C., 1998).

Открытие такой NOS в митохондрии ставит ряд вопросов и указывает новые возможные пути исследований. Во-первых, как образующийся митохондриальный NO влияет на апоптоз, ведь известно, что немитохондриальный NO действует, в том числе и непосредственно на митохондрии, вызывая ряд явлений, приводящих к апоптозу. Таким образом, хотя это не доказано, логично предположить участие этой mtNOS в регуляции апоптоза. Тем более, что кроме NO она вырабатывает О2-, то есть может иметь отношение к производству активных форм кислорода, а значит к различным биологическим повреждениям.

В отношении апоптоза интересные данные были получены при изучении выхода цитохрома С из митохондрий после стимуляции mtNOS (Ghafourifar P. et al, 1999). Повышение уровня Са2+ в цитозоли - хорошо известный индуктор апоптоза, но только недавно выяснено, что при этом значительную роль играет mtNOS. Показано, что для этого типа апоптоза необходимо поглощение Са2+ митохондриями, при этом происходит активация mtNOS, и начинается выход цитохрома С в цитозоль. Одновременно происходит усиление перекисного окисления липидов (LPO). Выход цитохрома С, также как LPO предотвращается ингибиторами NOS (L-NMMA), поглотителем пероксинитрита (урат) и экспрессией Bcl-2. В результате сделан вывод, что при Са2+-индуцированной активации mtNOS, в митохондрии формируется пероксинитрит, что вызывает LPO и выход цитохрома С и в конечном счете приводит к картине типичного апоптоза. Дальнейшая проработка этих явлений, несомненно, внесет вклад в понимание роли митохондрий и NO в самых разных путях клеточной смерти. Например, недавно было показано (Brookes P.S. et al., 2000), что ингибирование митохондриальной NOS приводит к накоплению внутримитохондриального Са2+, то есть NO, вырабатываемый mtNOS препятствует накоплению Са2+. Поскольку именно повышение концентрации Са2+ в матриксе ответственно за изменение проницаемости митохондриальной мембраны, то делается вывод (противоположный описанному выше!), что митохондриальный NO замедляет открытие гигантской поры и выход цитохрома С.

Второй вопрос: как регулируется продукция NO в митохондриях. Исследования показывают, что регуляция синтеза NO может происходить за счет субстратов mtNOS (L-Arg, NADPH) и ее кофакторов (FMN, FAD, BH4) как это показано для других изоформ, но в остальном этот вопрос остается открытым. Наконец, в-третьих, этот эндогенный митохондриальный NO может быть очень важен для регуляции деятельности самой митохондрии, так как известен его ингибирующий эффект на цитохром-оксидазу (KIV), комплексы I и II электрон-транспортной цепи. Его реакция с кислородом может регулировать митохондриальное дыхание, изменяя доступность О2 для акцептирования электронов и, следовательно, влиять на энергообеспечение клетки. Впрочем, и этот аспект биологии митохондриального NO требует дальнейшего изучения.

Обобщая все эти данные, можно сказать, что митохондрия является центральным звеном, на котором сходится и регулируется множество сигнальных путей апоптоза. В этих путях митохондрия может играть первостепенную роль, обеспечивая инициацию проапоптотического каскада, как это происходит при стрессорных воздействиях (например, облучение или действие NO). С другой стороны, она может усиливать какой-либо апоптогенный сигнальный каскад, например, путь Fas-рецептора или TNF-рецептора, действующие на митохондрию через киназы.

Антиапоптотическое действие NO

Кроме подробно описанных эффектов цитотоксического действия NO в литературе имеется немало примеров, когда оксид азота оказывает цитопротекторное действие. Сравнивая приводимые ниже свидетельства антиапоптотического действия NO с описанным выше цитотоксическим действием, можно заметить, что по многим пунктам эти данные противоречат друг другу (см. рис. 2 и рис. 3). Это подтверждает вывод о том, что действие NO весьма неоднозначно и зависит от множества условий.

Защитный эффект низких доз NO. Предварительная обработка клеток макрофагов низкими, нетоксичными дозами GSNO (25-200 мкМ) вызывала резистентность к более высоким дозам GSNO (1мМ) при повторной экспозиции (Брюне Б. и др., 1998). Аналогичный эффект вызывала предварительная обработка макрофагов LPS, IFN-g в присутствии L-NMMA. Таким образом, индуцируемые защитные механизмы, которые подавляют вызванный NO апоптоз, активируются под действием веществ, выделяющих NO, а также в результате предварительной активации липополисахаридами или цитокинами. В других работах низкие дозы NO замедляли открытие гигантской поры и дальнейшие апоптотические события.

Антиапоптотическое действие NO через активацию рГЦ. Для некоторых типов клеток показано, что защитный эффект NO опосредуется через синтез cGMP (Тейлор Б.С. и др., 1998, Shen Ying H. et al., 1998). Причем такое действие оказывают достаточно низкие дозы NO, аналогичные тем, которые вырабатываются in vivo NO-синтазами. Предполагается, что генерация cGMP может активировать cGMP-зависимые протеин-киназы, которые в свою очередь, влияют на белки апоптотических каскадов (например, каспазы или Bcl-2) (Mallozzi C. et al., 1999).

NO и защитные белки. В ряде работ показано усиление экспрессии белков теплового шока (Hsp) и белков Bcl-2 семейства. Белки теплового шока служат для защиты клетки от различных стрессорных воздействий, в основном повышения температуры, но также от окислительного стресса и цитокин-индуцированной цитотоксичности. Выявлено защитное действие NO при обработке гепатоцитов фактором некроза опухолей (Kim Y. et al., 1997) и при лишении клеток сыворотки (Малышев И.Ю. и Манухина Е.Б., 1998; Тейлор Б.С. и др., 1998). В обоих случаях антиапоптотическое действие NO коррелировало с увеличением синтеза Hsp70. Для Hsp70 характерна функция молекулярного шаперона, то есть помощника при сворачивании белков и удалении поврежденных белков. Kim Y. et al. предлагают роль Hsp70 в защите клетки от АФК и повреждений митохондрий через подавление взаимодействия белков, проводящих смертельные сигналы к митохондрии.

Bcl-2 - это известный протоонкоген, свойства которого как антиапоптотического белка уже описывались выше. Повышение его экспрессии при обработке NO (Rоssig L. et al., 2000) предотвращает апоптоз, вероятнее всего, через ингибирование открытия гигантской поры.

Оксид азота и супероксид-анион. Как NO, так и О2- являются важными медиаторами воспаления. Известно, что активированные макрофаги выделяют и NO, и О2-. Обычно считается, что взаимодействие этих радикалов приводит к появлению еще более ядовитого для клетки пероксинитрита (Маеда Х. и Акаике Т., 1998; Albina J.E. and Reichner J.S., 1998; Estevez A.G. et al., 1999). Однако, есть данные, что совместная инкубация клеток с NO и О2- вызывает перекрестный защитный эффект, тогда как по отдельности оба радикала вызывают апоптоз или некроз (Брюне Б. и др., 1998). Считается, что в этом случае NO служит поглотителем О2-, нейтрализуя его отрицательные эффекты. Вероятно, защитный эффект требует сбалансированного присутствия NO и О2- и определенного редокс-состояния клетки, так как надо нейтрализовать ОNOО-, образование которого весьма вероятно.

Ингибирование каспаз. Поскольку в активном центре каспаз присутствует цистеин, а активные формы азота нитрозилируют SH-группы, то первое объяснение подавления каспазного каскада оксидом азота заключалось именно в подобном нитрозилировании функционально важного Cys. Недавно, Li с соавторами (Li J. et al., 1999) показали не только подавление оксидом азота активных каспаз, но и прерывание самой активации каспаз. Было выявлено, что протеолитическая активация каспаз 3 и 8 эффективно подавляется как эндогенным, так и экзогенным NO, причем частично это ингибирование не связано с S-нитрозилированием.

Таким образом, роль NO в ответах организма и клетки на действие окружающей среды очень многогранна и не ограничивается только цитотоксичностью, или наоборот, защитным эффектом. Скорее, она будет определяться соотношением стрессовых факторов и факторов выживания клетки, что и направит действие NO по тому или иному пути.

ЭКЗОГЕННЫЙ ОКСИД АЗОТА

В изучении влияния NO на клетки значительную помощь оказывают экзогенные доноры NO. Эти вещества широко используются в настоящее время для создания модельных систем in vitro, на которых можно изучать эффекты влияния NO на культуры различных клеток, или на отдельные компартменты клеток (изолированные митохондрии, ядра). Эти модели весьма популярны, поскольку значительно упрощают имеющуюся в организме систему взаимодействия NO с клетками. Так как оксид азота здесь поступает извне, то система оказывается независимой от NO-синтаз и их регуляции, а значит, результаты действия NO легче интерпретировать. Очевидно также, что в этом случае в значительной отсекаются эффекты других сигнальных веществ, которые могут сопутствовать биогенному NO (известно, например, что NOS в определенных условиях могут синтезировать О2-; с другой стороны, сигналы, активирующие NOS, могут активировать и пути, ведущие к появлению различных дополнительных медиаторов).

Экзогенные доноры, в отличие от L-Arg, содержат NO в структуре молекулы, и их действие заключается в высвобождении этой молекулы в чистом виде. По химической природе среди NO-доноров можно выделить следующие группы:

· Нитраты (такие как широко используемые в клинике нитроглицерин, нитропруссид натрия, нитросорбид),

· Нитриты (амилнитрит, NaNO2),

· Нитрозотиолы и вещества, образующие различные комплексы с NO: S-нитрозоглутатион (GSNO), S-нитрозо-N-ацетилпеницилл-амин (SNAP), диэтиламин-NO (DEA-NO), соль Руссина.

По механизму действия NO-доноры делятся на спонтанно (неферментативно) высвобождающие NO и на доноры, которым для выделения оксида азота необходимо взаимодействие с ферментами. На данный момент не существует доноров, которые можно было бы назвать идеальными для исследований. Во-первых, NO-доноры различаются по эффективности высвобождения NO и в разной степени способны влиять на клетки. Во-вторых, эти вещества могут являться источниками побочных соединений, часто обладающих токсичностью (выделяемый нитропруссидом цианид).

К числу перспективных доноров NO и потенциальных лекарственных препаратов относятся гетероциклические азотсодержащие соединения. Производные 1,2,5-оксадиазол-2-оксида (фуроксана) являются спонтанными или тиолзависимыми донорами оксида азота. Они генерируют NO при реакции с тиолами (Feelisch et al., 1992; Medana et al., 1994) или другими нуклеофилами (Sorba et al., 1997). При этом предполагается, что важную роль в активации продукции NO играют внутриклеточные тиолы.

Фуроксаны представляют собой высокоактивные вазодилятаторы и стимуляторы рГЦ (Ferioli et al., 1995). Эти соединения активируют рГЦ, ингибируют аггрегацию тромбоцитов и генерируют NO. Так, например, описана эндотелий-независимая спазмолитическая активность 3-фенил-4-фенилсульфонилфуроксана на препаратах аорты кролика, ингибирование активности тромбоцитов по цГМФ-зависимому механизму и тиолзависимая генерация NO (Civelli et al., 1994). Среди более чем 20 производных фуроксана наибольшей вазодилятационной активностью обладают CN-замещенные соединения (Ferioli et al., 1995). В этой же работе отмечено, что не во всех случаях NO-донорные свойства коррелируют с активацией рГЦ, ингибированием агрегации тромбоцитов и спазмолитическими характеристиками.

Таким образом, всестороннее исследование других видов активности, проявляемых соединениями фуроксанового ряда, в частности цитотоксической и апоптогенной, является необходимым компонентом комплексного подхода к изучению фармакологических характеристик этих биологически-активных соединений.

Изучение in vitro цитотоксической активности нового соединения из фуроксанового ряда - 3-нитро-4-фенилфуроксана и было целью данной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, несмотря на интенсивные исследования апоптоза, детальная картина путей регуляции этого процесса по-прежнему требует прояснения. Становится очевидно, что различные механизмы, активирующие или подавляющие клеточную гибель, очень тесно переплетены, и в действии какой-либо сигнальной молекулы часто трудно выделить про- или антиапоптотические составляющие. Ярким примером может служить монооксид азота, исследование свойств которого является центральным в данной работе. К настоящему времени в научной литературе можно найти почти равное количество свидетельств, как цитотоксического действия, так и защитных эффектов этого соединения. Все это очень осложняет переход от теоретических разработок к практическому использованию подобных веществ, поскольку при таком разнообразии эффектов in vitro трудно предсказать их воздействие на уровне многоклеточного организма. Таким образом, именно из узко направленных работ по выявлению воздействия конкретного соединения в конкретных условиях на развитие определенного сигнального пути строится целостная картина регуляции жизненных функций клетки.

Список литературы

Андреева Л.И., Иванова Л.И., Титова М.В., Петрова В.С. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. В.С. Новикова), Наука, Санкт-Петербург, с. 51-71.

Брюне Б., Сандау К., фонКнетен А. (1998) Биохимия, 63, 966-975.

Ванин А.Ф. (1998) Биохимия, 63, 867-869.

Винк Д.А., Водовоз Й., Кук Дж.А. , Кришна М.С., Ким С., Коффин Д., ДеГрафф В., Делюка А.М., Либманн Дж., Митчелл Дж.Б. (1998) Биохимия, 63, 948-957.

Горрен А.К.Ф., Майер Б. (1998) Биохимия, 63, 870 - 880.

Карпищенко А.И., Пастушенков В.Л., Михалева Н.П., Гавриленко И.С., Андреева Л.И. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. В.С. Новикова), Наука, Санкт-Петербург, с. 149-156.

Маеда Х., Акаике Т. (1998) Биохимия, 63, 1007-1019.

Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. (1998) Биохимия, 63, 992-1006.

Недоспасов А.А. (1998) Биохимия, 63, 881-904.

Новиков В.С., Булавин Д.В., Цыган В.Н. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. В.С. Новикова), Наука, Санкт-Петербург, с. 30-50.

Новиков В.С., Ястребов Д.В., Бахтин М.Ю. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. В.С. Новикова), Наука, Санкт-Петербург, с. 72-78.

Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков В.С. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. В.С. Новикова), Наука, Санкт-Петербург, с. 9-29.

Северина И.С. (1998) Биохимия, 63, 939-947.

Скулачев В.П. (1997) Биохимия, 62, 1394 - 1399.

Тейлор Б.С., Аларсон Л.Х., Биллиар Т.Р. (1998) Биохимия, 63, 905-923.

Хейфлик Л. (1997) Биохимия, 62, 1380 - 1393.

Albina J.E., Reichner J.S. (1998) Cancer and Metastasis Reviews, 17, 39-53.

Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V., Zimmer G. (1997) Eur J Biochem, 246, 710-718.

Bal-Price A., Brown G.C. (2000) J. Neurochem., 75, 1455-1464.

Beltran B., Mathur A., Duchen M.R., Erusalimsky J.D., Moncada S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14602-14607.

Borutaite V., Morkuniene R., Brown G.C. (2000) FEBS Letters, 467, 155-159.

Brookes P.S., Salinas E.P, Darley-Usmar K, Eiserich J.P, Freeman B.A, Darley-Usmar V.M, Anderson P.G (2000) J Biol Chem, 275, 20474-20479.

Cassina A.M., Hodara R., Souza J.M., Thomson L., Castro L., Ischiropoulos H., Freeman B.A., Radi R. (2000) J Biol Chem, 275, 21409-21415.

Chao D.T., Korsmeyer S.J. (1998) Annu. Rev. Immunol., 16, 395-419.

Civelli et al (1994) Eur. J. Pharm., 255, 17-24.

Crompton M. (1999) Biochem J, 341, 233-249.

Denizot F., Lang R. (1986) J. Imm. Meth, 89(2), 271-277.

Earnshaw W.C. (1999) Nature, 397, 387-389.

Estevez A.G., Spear N., PelluffoH., Kamaid A., Barberro L., Beckman J.S. (1999) Methods in Enzimology, 301, 393-402

Feelisch et al. (1992) Biochem. Pharmacol., 44, 1149-1157.

Ferioli et al. (1995) Brit. J. Pharm., 114, 816-820.

Geller D.A., Billiar T.R. (1998) Cancer and Metastasis Reviews, 17, 7-23.

Ghafourifar P., Schenk U., Klein S.D., Richter C. (1999) J Biol Chem, 274, 31185-31188.

Giulivi C., Poderoso J.J., Boveris A. (1998) J Biol Chem, 273, 11038-11043.

Glockzin S., Knethen A., Scheffner M., Brune B. (1999) J Biol Chem, 274, 19581-19586.

Gottlieb R.A. (2000) FEBS Letters, 482, 6-12.

Haunstetter A., Izumo S. (1998) Circ Res, 82, 1111-1129.

Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S., Yonehara S., Sawai H., Okazaki T., Yamamoto K., Sasada M. (1998) J. Exp. Med., 187(4), 587-600.

Hortelano S., Dallaporta B., Zamzami N., Hirsch T., Susin S.A, Marzo I., Bosca L., Kroemer G. (1997) FEBS Letters, 410, 373-377.

Kagan V.E., Fabisiak J.P. , Shvedova A.A. , Tyurina Y.Y., Tyurin V.A. , Schor N.F. , Kawai K. (2000) FEBS Letters, 477, 1-7.

Kidd V.J. (1998) Annu. Rev. Physiol., 60, 533-573.

Kim Y., de Vera M.E., Watkinsi S.C., Billiar T.R. (1997) J Biol Chem, 272, 1402-1411.

Koc E.C., Ranasinghe A., Burkhart W., Blackburn K., Koc H., Moseley A., Spremulli L.L. (2001) FEBS Letters, 492, 166-170.

Kowaltowski A.J., Castilho R.F., Vercesi A.E. (2001) FEBS Letters, 495, 12-15.

Kroemer G., Dallaporta B., Resche-Rigon M. (1998) Annu. Rev. Physiol., 60, 619-642.

Li J., Bombeck C.A., Yang S., Kim Y., Billiar T.R. (1999) J Biol Chem, 274, 17325-17333.

Mailhos C., Howard M.K., Latchman D.S. (1994) J Neurochem, 63, 1787-1795.

Mallozzi C., Stasi A.M.M.D., Minetti M. (1999) FEBS Letters, 456, 201-206.

Mattson M.P., Barger S.W., Begley J.G., Mark R.J. (1995) Methods in cell biology, 46, 187-216.

McGahon A.J, Martin S.J., Bissonnette R.P., Mahboubi A., Shi Y., Mogil R.J., Nishioka W.K., Green D.R. (1995) Methods in cell biology, 46, 153-185.

Medana et al. (1994) J. Med. Chem., 37, 4412-4416.

Messmer U.K., Brune B. (1996) Biochem. J., 319, 299-305.

Moll U.M., Zaika A. (2001) FEBS Letters, 493, 65-69.

Moriya R., Uehara T., Nomura Y. (2000) FEBS Letters, 484, 253-260.

Nedospasov A., Rafikov R., Beda N., Nudler E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 13543-13548.

Reiter C.D., Teng R.-J., Beckman J.S. (2000) J. Biol. Chem., 275, 32460-32466.

Rossig L., Haendeler J., Hermann C., Malchow P., Urbich C., Zeiher A.M., Dimmeler S. (2000) J Biol Chem, 275, 25502-25507.

Salvioli S., Barbi C., Dobrucki J., Moretti L., Pinti M., Pedrazzi J., Pazienza T.L., Bobyleva V., Franceschi C., Cossarizza A. (2000) FEBS Letters, 469, 186-190.

Sapozhnikov A.M., Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Telford W.G. (1999) Cell Prolif, 32, 363-378.

Shen Ying H., Wang Xing L., Wilcken David E.L. (1998) FEBS Letters, 433, 125-131.

Skulachev V.P. (2000a) Free Radic. Biol. Med., 29(10), 1056-1059.

Skulachev V.P. (2000b) IUBMB Life, 49, 365-373.

Sorba et al. (1997) J. Med. Chem., 40, 463-469.

Stuehr D., Pou S., Rosen G.M. (2001) JBC (papers in press).

Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E., Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G. (1999) Nature, 397, 441-446.

Tatoyan A., Giulivi C. (1998) J Biol Chem, 273, 11044-11048.

Tejedo J., Bernabe J.C., Ramirez R., Sobrino F., Bedoya F.J. (1999) FEBS Letters, 459, 238-243.

Torres J., Sharpe M.A., Rosquist A., Cooper C.E., Wilson M.T. (2000) FEBS Letters, 475, 263-266.

Tsujimoto Y., Shimizu S. (2000) FEBS Letters, 466, 6-10.

Ushmorov A.., Ratter F., Lehmann V., Droge W., Schirrmacher V., Umansky V. (1999) Blood, 93, 2342-2352.

Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Williamson E.K., Schumacker P.T., Thompson C.B. (1997) Cell, 91, 627-637.

Yaglom J.A., Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D., Sherman M.Y. (1999) J Biol Chem, 274, 20223-20228.

Zhai D., Huang X., Han X., Yang F. (2000) FEBS Letters, 472, 293-296.